警惕对虾微胶囊饲料可携带虾肝肠胞虫

虾肝肠胞虫 (EHP)又称“肠胞虫”，大小约为0.7～1.1μm，属于微孢子虫科，肠胞虫属，是一种可感染多种真核生物的专性细胞内寄生虫。作为养殖对虾的重要病原，近年来各地都有检出的报道，且呈上升趋势，该寄生虫正严重威胁着整个对虾养殖产业的发展。目前业内普遍认为虾肝肠胞虫不引发对虾死亡，但会导致生长迟缓甚至停滞，空耗饲料，由此带来的损失比虾死亡还大。全国水产技术推广总站于2017年将EHP列为新发的重大水生动物疫病，要求重点防控。

杭州市从2016起将EHP列为南美白对虾苗种的主要检测项目，每年对20多家淡化苗场的50余批次虾苗样品进行检测。2018年3月，在联系调查阳性样时发现一处南美白对虾淡化苗场怀疑因投喂微胶囊饲料而受到感染，进一步跟踪检测表明携带虾肝肠胞虫的微胶囊饲料为主要感染来源，现将相关情况总结如下，供参考。

一、检测方法

样品采集按照SC/T 7103-2008《水生动物产地检疫采样技术规范》。虾肝肠胞虫检测采用巢式PCR方法。DNA提取使用Qiagen DNA Mini Kit 试剂盒。第一步扩增引物为: 514F：5`-TTG-CAG-AGT-GTT-GTT-AAG-GGT-TT-3`和514R：5`-CAC-GAT-GTG-TCT-TTG-CAA-TTT-TC-3`；第二步扩增引物为148F：5`-TTG-GCG-GCA-CAA-TTC-TCA-AAC-A-3`和148R：5`-GCT-GTT-TGT-CTC-CAA-CTG-TAT-TTG-A-3`。扩增程序为95℃ 5分钟; 95℃ 30秒、58℃ 30秒，68℃45秒，30个循环; 68℃5分钟。PCR产物经电泳后，割胶回收送Takara公司进行克隆测序，所得序列通过NCBI的BLAST检索系统进行序列同源性分析。

二、相关检测情况

2018年3月，在开展南美白对虾苗种疫病监测工作时，检出某淡化苗场一批次南美白对虾苗EHP阳性（套式PCR，第一步阴性，第二步阳性）。据了解，该虾苗为品牌一代苗，且购入时有原生产单位的病源检测EHP阴性证明。反复排查后，怀疑投喂的微胶囊饲料携带EHP病源，故随机抽取两包未拆封的微胶囊饲料（同一批次），进行EHP检测，结果显示EHP的两步扩增均获得了阳性条带，对第二步扩增阳性产物进行测序，所获序列经BLAST与虾肝肠胞虫SWP基因相似度达到100%。

为分析微胶囊饲料中携带的虾肝肠胞虫是否会感染南美白对虾苗种，进行了分池投喂：同一批规格为0.5cm品牌一代苗，且EHP检测阴性，分两池淡化培育，一池投喂微胶囊饲料、一池投喂普通虾片，其他管理相同；培育7天后进行跟踪检测，相关检测结果见下表：

如表1所示，投喂7天后采样检测，显示投喂微胶囊饲料的白对虾苗种EHP全部阳性（套式PCR，第一步阴性，第二步阳性），且随机抽取一个阳性扩增产物进行测序，所获序列经BLAST与虾肝肠胞虫SWP基因相似度达100%，而投喂虾片的白对虾苗种EHP全部阴性。

该淡化苗种场对EHP检测阳性的虾苗、水体及周围环境等按《染疫水生动物无害化处理规程(SC/T7015-2011)》进行了处理。

三、讨论与分析

目前虾肝肠胞虫已有从对虾、卤虫、水环境中检出的报道，也有报道称鱼类为其中间宿主，未见人工配合饲料中检出的报道，从微胶囊饲料中检出EHP阳性尚属首次。生产中EHP治疗困难，目前以预防为主，因此对于饲料中携带EHP的情况需要加强重视，及早防范其带来的危害。

从杭州市虾肝肠胞虫实际来看，虾苗中EPH阳性率在2018年已有明显回落（2017年EPH阳性检出率44.0%，2018年16.0 %），但养殖过程中发病情况依然较多。可见因EPH病害的流行，孢子在外环境中慢慢积累，从卤虫、水环境中以至此次从微胶囊饲料中检出EHP阳性证明了这一点。因此，笔者认为，今后对于EPH的防疫，除了继续做好苗种的监测外，应更加重视投入品及本底环境中EPH的监测。

微胶囊饲料检出EPH可能与其蛋白来源有关。该微胶囊饲料为铝箔袋真空封装，包装显示粗蛋白含量为52%，颗粒直径约0.2mm，是优质新鲜海产蛋白质，但未说明蛋白具体来源。虾肝肠胞虫的孢子个体微小（0.7×1.1μm），对高温干燥、常用消毒剂等不良环境的耐受力很高。而在微胶囊饲料加工工艺中一般原料超微粉碎至25～38μm（500～400目筛），无法对EHP孢子破壁；至于普通虾类饲料粉碎粒度要求为过100目筛（165μm），孔目更大。熟化、烘干等其他饲料加工工艺，对于细胞形态的病源生物有效，但是否能确保杀灭孢子有待进一步商榷。另一方面，EPH的PCR检测等检测技术已较为成熟，且在苗种生产上运用多年，对原料的检测是目前饲料生产上防范EPH的主要手段，有关饲料生产厂家应加强重视。