警惕卤虫可携带虾肝肠胞虫

虾肝肠胞虫又称“肠孢虫”，属于微孢子虫科，肠胞虫属，是一种可感染多种真核生物的专性细胞内寄生虫。该病原最早于2004年作为一种未知微孢子虫在泰国生长缓慢的斑节对虾肝胰腺小管上皮细胞内被发现，在2009年获得分类和命名，主要危害对虾类，目前普遍认为虾肝肠胞虫与养殖对虾的生长迟缓相关，近年来各地都有虾肝肠胞虫检出的报道，且呈上升趋势，该寄生虫正严重威胁着整个对虾养殖产业的发展。

卤虫是一类广泛分布于世界沿海盐田和内陆盐湖等的小型甲壳动物，属于节肢动物门、甲壳纲、腮足亚纲、无甲目、卤虫科。由于其成体中含有多种蛋白质等营养成分，可增强鱼虾的抗病力和对环境的适应性，是养殖虾、蟹类幼体培育后期及仔虾期的重要鲜活饵料，国内外研究表明卤虫可携带鳗弧菌、野田村病毒、感染性肝胰腺坏死病毒和白斑病毒等病原微生物。鉴于目前国内外虾肝肠胞虫的流行，我们抽取了卤虫样品进行了肠胞虫的检测，并检测到了该病原的携带，现将有关情况总结如下。

1. 检测样品获取

从杭州市南美白对虾主养区5处养民处获取其购买的商品化冰冻成体卤虫10个批次，商品化卤虫卵5个批次，以及由商品化卤虫卵孵化所得的卤虫幼体10批次，用95%酒精溶液浸泡保存于-20℃备用。

1. 检测方法

使用巢式PCR方法对获取样品进行肠胞虫检测。DNA提取使用Qiagen DNA Mini Kit试剂盒。第一步扩增引物为：779F:CAGCAGGCGCGAAAATTGTCCA和779R:AAGAGATATTGTATTGCGCTTGCTG。扩增程序为94°C 3分钟；94°C 29秒, 60°C 29秒, 72°C 29秒, 35个循环；72°C 5分钟。第二步扩增引物为176F:CAACGCGGGAAAACTTACCA和176R:ACCTGTTATTGCCTTCTCCCTCC。扩增程序为94°C 3分钟；94°C 20秒，68°C 20秒, 72°C 20秒, 35 个循环；72°C 5分钟。PCR产物经电泳后，回收第二步扩增阳性条带，送Takara公司进行克隆测序。测序所得序列通过NCBI的BLAST检索系统进行序列同源性分析。

1. 检测结果

    依照上述方法，对采集的25批次卤虫样本进行了虾肝肠胞虫检测，其中在5个批次的冰冻成体卤虫中第一步扩增即检测到779bp的目的条带。挑取第二步扩增的阳性产物进行测序，获得了176bp的序列，该序列与目的基因虾肝肠胞虫SSU RNA相应片段序列相似性达到100%。

表1  卤虫样品肠胞虫检测结果

1. 讨论

1、本文采用了巢氏PCR方法以提高检测的灵敏度和特异性，之后又对扩增产物进行测序，以确认检测到的目的基因属于虾肝肠胞虫，而非该方法可能出现的假阳性产物，之后又反复对阳性样品进行了重复检测，结果均表明，部分市售冰冻成体卤虫携带了虾肝肠胞虫，并且第一步扩增即可见阳性条带，表明这些卤虫的肠胞虫携带量在一个相对较高水平。

2、国内外研究表明，虾肝肠胞虫可经口摄食传播，也可通过患病虾和健康虾的共同养殖进行水平传播。而本文中涉及的检测样品为直接或间接投喂对虾的饵料，笔者后续的研究表明这些卤虫携带的虾肝肠胞虫存在着一定的生物活性，因此虽然未进行进一步的动物实验证实，但使用这样的卤虫进行投喂，很可能使健康虾感染。

3、从检测的情况来看，商品化卤虫卵及其孵化所得的卤虫幼体未检测到虾肝肠胞虫的携带，说明在一定程度上，其安全性可能要高于冰冻的成体卤虫。但卤虫卵是否可携带肠胞虫，卤虫样品中的肠胞虫是机械性携带还是感染，如果是感染，是否可在卤虫世代中进行垂直传播，这些问题均有待于进一步研究。从指导生产的角度，有必要提醒广大对虾养民，注意市售卤虫的质量，有条件的地方在使用前，要对卤虫进行相关检测，确保没有问题之后再使用。